抗體偶聯(lián)藥物(ADC)研究的好幫手

賽多利斯實驗室

2022.12.13

近年來，抗體療法在多種疾病的新療法的發(fā)現(xiàn)中展現(xiàn)出不俗的實力。在癌癥治療領(lǐng)域，抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的研究如火如荼。ADC利用單克隆抗體（mAbs）的特異性，通過將細胞毒性藥物直接傳遞到表達特征標記或抗原的腫瘤細胞，實現(xiàn)靶向細胞死亡。乳腺癌臨床用藥Kadcyla? 是由靶向HER2的曲妥珠單抗（赫賽汀?）與細胞毒性藥物伊美坦辛（DM1）偶聯(lián)的ADC藥物。

其作用機制（MoA）如下：

DM1定向轉(zhuǎn)運至HER2陽性細胞

曲妥珠單抗介導HER2信號通路的抑制作用

抑制HER2胞外結(jié)構(gòu)域從細胞膜上脫落

抗體介導的ADCC作用

其中第一項機制基于抗體與細胞表面HER2的高效結(jié)合及藥物內(nèi)化后引起的DM1分子胞內(nèi)釋放?；诖?，考察ADC藥物的結(jié)合、內(nèi)化和毒性實驗是研發(fā)環(huán)節(jié)中必不可少的，而這些動態(tài)變化的過程均可由Incucyte? 實時活細胞分析系統(tǒng)捕捉并完成分析。

Kadcyla?結(jié)構(gòu)示意圖

抗體內(nèi)化

方法：

Incucyte? Human Fabfluor-pH Antibody Labeling Dye可通過一步法特異性標記人IgG的Fc段，其pH敏感性可實現(xiàn)：被標記的復合物與特定的表位結(jié)合后被細胞內(nèi)化，進入低pH值的溶酶體環(huán)境中，pH值的變化導致染料產(chǎn)生熒光，結(jié)合Incucyte? 使抗體內(nèi)化過程可視化。

加入標記后的抗體藥物12小時后，Kadcyla? 與曲妥珠單抗均在HER2陽性乳腺癌細胞AU565中表現(xiàn)出較高的內(nèi)化水平（較IgG陰性對照組及低HER2表達的MDA-MB-231細胞組）。6 μg/mL Kadcyla?組在< 6 h時已進入平臺期。Kadcyla? 與曲妥珠單抗24小時 EC50值分別為0.38 μg/mL，0.22 μg/mL，兩者表現(xiàn)出類似的結(jié)合特異性及內(nèi)化效應(yīng)。

細胞增殖

方法：

Incucyte? Nuclight Green Lentivirus 試劑使AU565細胞穩(wěn)定表達綠色的核熒光信號。Incucyte? 可實時捕捉圖像，分析細胞核數(shù)量以表征細胞增殖狀態(tài)。

Kadcyla? 中的DM1是一種微管蛋白抑制劑，可抑制微管的組裝，導致細胞周期的中斷，從而導致有絲分裂停止，然后死亡。當Kadcyla? 內(nèi)化到溶酶體中時，DM1被裂解并釋放到細胞中，并發(fā)揮作用。

在藥物作用72小時后，Kadcyla? （1.5 μg/mL）組的細胞顯現(xiàn)出不健康的細胞形態(tài)，且其增殖明顯被抑制（較IgG陰性對照組及曲妥珠單抗組）。Kadcyla? 對細胞增殖的抑制作用的IC50為0.24 μg/mL，與內(nèi)化效價相似，并顯示出與喜樹堿相當?shù)淖畲蠹毎麣饔?。使用細胞健康指示劑Incucyte? Annexin V Dye （0.30 μg/mL，數(shù)據(jù)未顯示）測定的Kadcyla? 細胞凋亡效價一致。

細胞周期

方法：

Incucyte? Cell Cycle Lentivirus 試劑使AU565細胞穩(wěn)定表達G1期及S/G2/M期熒光指示劑，該試劑不影響細胞正常功能。在S/G2/M期細胞核呈綠色熒光；在M至G1期細胞核無色；在G1期細胞核呈紅色熒光；在G1至S期細胞核呈黃色（綠色與紅色疊加）熒光。Incucyte? 可實時捕捉圖像，Incucyte? Cell-by-Cell模塊可分析不同顏色細胞核數(shù)量以表征細胞周期狀態(tài)。

在正常情況下的AU565細胞周期不同時相細胞百分比的表現(xiàn)為綠色（S/G2/ M, 40±3%）、紅色（G1, 24±2%）、黃色（G1/ S, 15±2%）或無色（M/G1, 20±4%）。經(jīng)Kadcyla?（3 μg/mL）處理的AU565細胞在最初24小時內(nèi)，紅色細胞減少（下降至13%），無色細胞增加（上升至27%），表明在M/G1期周期停止。36 h時，圖像主要顯示綠色細胞（24%）和非熒光細胞（52%），再加上它們越來越圓的形態(tài)，表明在周期停滯發(fā)生在有絲分裂階段附近。48小時后，細胞形態(tài)看起來不健康，正在死亡。而同型對照IgG或曲妥珠單抗（數(shù)據(jù)未顯示）的影響甚微。

ADCC

方法：

穩(wěn)定表達綠色核熒光信號的AU565靶細胞與NK細胞以5：1的效靶比于不同濃度Kadcyla? 樣本組中共培養(yǎng)。培養(yǎng)基中加入Incucyte? Annexin V NIR Dye以表征細胞凋亡信號。Incucyte? 可實時捕捉圖像，分析靶細胞數(shù)量及凋亡信號以表征ADCC效應(yīng)。為了展示Kadcyla? 的綜合療效，將其通過常規(guī)ADCC（與直接殺傷結(jié)合使用）殺死靶細胞的能力與其在單一培養(yǎng)中的直接細胞毒性作用（ monoculture）進行了比較。

在單培養(yǎng)和共培養(yǎng)孔中，綠色熒光均出現(xiàn)藥物濃度相關(guān)的下降，表明Kadcyla?處理的靶細胞死亡。從圖像中可以明顯看出，在NK存在的情況下，附加的ADCC效應(yīng)比單獨的直接細胞毒性效應(yīng)更強。ADCC對靶細胞的殺傷速度更快，作用強約25倍（EC50：直接細胞毒0.27 μg/mL, ADCC為0.011 μg/mL）。Annexin V信號也展示了類似的數(shù)據(jù)。96 h時的數(shù)據(jù)表明ADCC共培養(yǎng)模型對靶細胞的清除有所改善，這與Kadcyla?對腫瘤細胞清除的高臨床療效一致。

為了進一步了解Kadcyla? 在ADCC 實驗中的生物學作用，使用iQue? 人NK細胞殺傷試劑盒結(jié)合iQue? 高通量流式細胞儀平臺分析NK細胞的激活狀態(tài)。

Kadcyla?在24小時和48小時誘導CD3-CD56+ NK細胞上CD25表達明顯的濃度依賴性增加，表明NK細胞被激活。

Kadcyla?還可誘導NK細胞CD16水平的降低。CD16脫落與NK細胞的激活有關(guān)，在ADCC過程中，CD16脫落參與了NK細胞和靶細胞的分離，并可能導致連環(huán)效應(yīng)。

Kadcyla?處理后IFNγ分泌也有濃度依賴性增加，表明其與NK激活有關(guān)。

以上數(shù)據(jù)支持Kadcyla? 在NK細胞存在的情況下處理HER2表達的靶細胞，導致NK細胞的激活，從而誘導ADCC效應(yīng)。

綜上所述，Incucyte? 活細胞分析系統(tǒng)在 Kadcyla? 作為ADC藥物的應(yīng)用實例，該分析方法能夠?qū)adcyla? 的抗體內(nèi)化、細胞增殖、細胞周期及ADCC效應(yīng)進行簡單、清晰的可視化和量化。

Kadcyla? 可特異性結(jié)合HER2表達細胞，內(nèi)化效率和效力與曲妥珠單抗相似。

與曲妥珠單抗不同，Kadcyla? 一旦內(nèi)化，通過釋放細胞毒性負載DM1(一種有效的微管蛋白抑制劑)導致細胞定向死亡。

Kadcyla? 介導的ADCC活性和直接殺傷的聯(lián)合作用提高了清除腫瘤細胞的效率。

為何選擇Incucyte? 實時活細胞分析系統(tǒng)？

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