ADC藥物DAR值分析的主要技術(shù)

丹納赫生命科學(xué)

2022.2.28

抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）是一類通過特定的連接子將靶向單克隆抗體與高殺傷性的細(xì)胞毒性小分子藥物偶聯(lián)起來的生物藥，以單克隆抗體為載體將小分子細(xì)胞毒性藥物高效地運(yùn)輸至目標(biāo)腫瘤細(xì)胞中，起到治療的目的。

ADC藥物的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)

（Lancet Oncol. 2016 Jun; 17(6): e254–e262.）

近年來，隨著新的連接子、小分子毒素、抗體以及靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)的不斷更新，ADC藥物也發(fā)展迅速，僅2019年一年，F(xiàn)DA就批準(zhǔn)了三款A(yù)DC藥物，榮昌生物的國(guó)產(chǎn)ADC維迪西妥單抗也在2021年6月獲NMPA批準(zhǔn)上市。目前，?全球有100多項(xiàng)ADC藥物相關(guān)的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。

小分子毒素抗體比DAR（drug-to-antibody ratio）是ADC藥物獨(dú)特的重要質(zhì)量屬性，它代表抗體偶聯(lián)小分子毒性藥物的平均數(shù)量，較低的DAR會(huì)降低ADC的效力，但過高的DAR又會(huì)影響ADC分析的藥代動(dòng)力學(xué)和毒性，普遍認(rèn)為DAR在2-4之間是ADC藥物的最優(yōu)選。而偶聯(lián)方式是影響DAR的重要因素，只有選擇合適的偶聯(lián)技術(shù)，才能讓ADC的毒素均一穩(wěn)定地連接在抗體上。

目前主要有三種偶聯(lián)方式：1) 通過暴露在抗體表面的賴氨酸,?2) 還原鏈間二硫鍵的半胱氨酸,?3) 定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)來進(jìn)行偶聯(lián)。其中賴氨酸偶聯(lián)的位點(diǎn)較多，每個(gè)抗體上可以掛0~8個(gè)小分子毒素，導(dǎo)致每一批次的ADC產(chǎn)品異質(zhì)性較大。而半胱氨酸偶聯(lián)，由于二硫鍵的位置是固定的，所以偶聯(lián)位置也相對(duì)可控，但是其鏈接小分子毒素的個(gè)數(shù)取決于二硫鍵的還原程度。當(dāng)4條鏈間二硫鍵均被完全還原時(shí)，能攜帶8個(gè)毒素；當(dāng)它被部分還原時(shí)，則可能生成DAR為2、4、6、8的產(chǎn)物，半胱氨酸偶聯(lián)產(chǎn)物較賴氨酸，其均一性已經(jīng)顯著提高。定點(diǎn)偶聯(lián)主要是使用生物技術(shù)人為地在單抗上引入鏈接位點(diǎn)。隨著ADC偶聯(lián)方式的進(jìn)步，ADC藥物抗體比不均的問題也被逐步改善。

半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物DAR分布（光譜網(wǎng)）

藥物偶聯(lián)的程度會(huì)影響ADC藥物的穩(wěn)定性和聚集傾向，所以，DAR值是進(jìn)行ADC藥物分析的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，是ADC藥物研發(fā)過程重要的質(zhì)控環(huán)節(jié)。色譜和質(zhì)譜是檢測(cè)DAR值的兩種常用方法。丹納赫生命科學(xué)旗下艾杰爾-飛諾美bioZen系列色譜柱，可以出色地完成ADC藥物的分離表征。

艾杰爾-飛諾美色譜柱

對(duì)曲妥珠單抗mc-MMAF半胱氨酸偶聯(lián)物的液相色譜檢測(cè)

色譜柱：bioZen Intact XB-C8, 3.6 μm

規(guī)格：150 x 2.1 mm

流動(dòng)相A：0.1 % TFA 水溶液

流動(dòng)相B：01 % TFA in ACN

流速：0.4mL/min

梯度：28-34 %B in 1-4 minutes ；

? ? ? ? ? 34-65% B in 4-10 minutes

檢測(cè)器：LC-UV（280nm）

溫度：80℃

樣品：曲妥單抗mcMMAF半胱氨酸偶聯(lián)物來源于ADC Biotechnology LTD

以上圖譜通過裸抗（黑色峰圖）及鏈接小分子抗體（藍(lán)色峰圖）的對(duì)比分析，推斷輕、重鏈上鏈接小分子的個(gè)數(shù)，再根據(jù)峰面積計(jì)算DAR值。該條件使用的bioZen 3.6 μm XB-C8 色譜柱，采用核殼技術(shù)，改善了蛋白的回收率，并且能夠耐受90度的高溫，維持結(jié)果穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的不銹鋼硬件相比，艾杰爾-飛諾美的bioZen系列色譜柱在殼上鏈接了丁基固定相，可大幅減少次級(jí)相互作用、殘留和其他回收問題，并降低預(yù)平衡時(shí)間，避免干擾蛋白質(zhì)或肽的完整性。

艾杰爾-飛諾美 bioZen3.6 μm XB-C8 柱子結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)

艾杰爾-飛諾美Biozen色譜柱

對(duì)曲妥珠單抗不同偶聯(lián)小分子毒素的HPLC表征

采用丹納赫生命科學(xué)旗下SCIEX的高分辨質(zhì)譜，還可以根據(jù)ADC藥物的分子量對(duì)DAR值進(jìn)行分析。對(duì)于賴氨酸偶聯(lián)的ADC藥物，采用反向色譜法進(jìn)行分離，進(jìn)入質(zhì)譜得到抗體的多電荷信號(hào)后，結(jié)合軟件去卷積對(duì)分子量進(jìn)行分析，從而鑒定鏈接小分子的個(gè)數(shù)。

SCIEX 高分辨質(zhì)譜ZenoTOF? 7600系統(tǒng)

賴氨酸偶聯(lián)的ADC藥物質(zhì)譜檢測(cè)圖譜

SCIEX 高分辨質(zhì)譜ZenoTOF? 7600系統(tǒng)可以精確地檢測(cè)ADC的分子量，軟件分析顯示實(shí)際檢測(cè)的分子量數(shù)值與理論數(shù)值平均誤差小于2 Da。采用BiopharmaView軟件根據(jù)鏈接小分子圖譜的峰面積及載藥負(fù)荷能夠方便快捷地計(jì)算ADC藥物的DAR值。

BiopharmaView 軟件對(duì)ADC的分子量進(jìn)行計(jì)算

BiopharmaView 軟件對(duì)ADC的DAR值進(jìn)行計(jì)算

同時(shí)，對(duì)于半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物，可以采用非變性的模式進(jìn)行分子量的檢測(cè)，從而分析DAR值。

半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物質(zhì)譜檢測(cè)圖譜

對(duì)于ADC藥物的開發(fā)而言，如何依據(jù)藥物的偶聯(lián)方式及目標(biāo)屬性去選擇合適的質(zhì)量控制方法、質(zhì)量控制項(xiàng)目與性質(zhì)合適的耗材，是助力藥物從理論設(shè)計(jì)走向?qū)嶒?yàn)室制備的重要環(huán)節(jié)。丹納赫生命科學(xué)提供的兩種ADC藥物DAR值分析方法，不僅能給用戶提供不同的選擇，還能幫助用戶進(jìn)行不同方法的相互驗(yàn)證，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

丹納赫生命科學(xué)2022第一課

ADC藥物的質(zhì)量分析

由于兼具單抗藥物的高靶向性以及細(xì)胞毒素在腫瘤組織中高活性的雙重優(yōu)點(diǎn)， ADC藥物較化療藥物副作用更低，較傳統(tǒng)抗體類腫瘤藥物具有更好的療效，被稱為腫瘤治療領(lǐng)域的“生物導(dǎo)彈”。

ADC藥物由于在單克隆抗體上引入偶聯(lián)位點(diǎn)，通過連接子與小分子藥物連接，實(shí)際存在的蛋白種類是非常復(fù)雜的，也因此給藥物的表征帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

丹納赫生命科學(xué)擁有多種ADC藥物的表征技術(shù)，將于3月17日開設(shè)本年度的第一堂培訓(xùn)課程，介紹單抗的結(jié)構(gòu)表征、DAR值計(jì)算、偶聯(lián)位點(diǎn)確證、小分子藥物的定量等一系列ADC藥物的質(zhì)量分析手段。歡迎感興趣的伙伴們報(bào)名參加。

時(shí)間：

2022年3月17日

地點(diǎn)：

上海市長(zhǎng)寧區(qū)福泉路518號(hào)2座1樓

課程安排：

主要內(nèi)容

時(shí)間

丹納赫生命科學(xué)介紹

9:15-9:20

ADC藥物的液相色譜分析解決方案

9:20-9:50

高分辨質(zhì)譜在ADC藥物表征中的應(yīng)用