小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的分析
實驗概要
本實驗主要介紹從小鼠大腦分離的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能。
實驗步驟
為了檢測小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能，利用凋亡的神經(jīng)祖細(xì)胞作為目標(biāo)，因為在體外環(huán)境下它能最模擬自然條件下小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬目標(biāo)。
1. 將神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）置于0.1M PBS 2mg/ml木瓜蛋白酶（Worthington）溶液中進(jìn)行分離，37oC作用30min。
2. 將分離的NPC 在紫外光下處理15-20min。
注：此步應(yīng)該在一個很薄的塑料培養(yǎng)皿中進(jìn)行，厚的塑料（如15或50毫升錐形管）將阻止很大部分紫外線光，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不理想。
3. 用含40mL PBS（RT）的50 mL錐形管中洗NPC，室溫離心（1200 轉(zhuǎn)/min，7min），緩慢減速，棄掉上清液。
4. 室溫條件下在5 mL 0 .1 M PBS溶液中重懸NPC。
5. 向NPC中加入5mL sta 5（6）-TAMRA，SE（Invitrogen公司），立即渦旋， 37oC避光孵育15min。
6. 用40 mL預(yù)冷的0.1M PBS洗3次（如步驟3）。
7. 將NPC懸浮在1 mL DMEM / F12（Invitrogen公司）培養(yǎng)液中雙抗（Invitrogen公司），用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞。稀釋或濃縮細(xì)胞數(shù)至5 ×10 6每毫升。
8. 按10:1的比例，將NPC加至小膠質(zhì)細(xì)胞（已經(jīng)吸附于24孔板中蓋玻片上），加入含10％胎牛血清（Atlanta生物）雙抗的900mL DMEM / F12培養(yǎng)基。
9. 置于37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
10. 在所需的時間點（如1h，2h和5h）從培養(yǎng)箱中拿出。
11. 在無菌環(huán)境中，用鉗子拿出蓋玻片，在溫?zé)岬腜BS中輕柔的浸洗20次（除去未吞噬的NPC）。將蓋玻片置于含1mL4％PFA的24孔板中，再次放置蓋玻片于培養(yǎng)箱中等待下個所需的時間點。
12. 將細(xì)胞固定于蓋玻片上，避光20min，用0.1M PBS洗3次。
13. 用含10％血清、0.3％的Triton X-100和0.5％BSA的PBS溶液，避光作用1小時封閉蓋玻片。
14. 滴加CD11b的抗體（1:100）（eBioscience），避光，常溫孵育1h。
15. 用0.1M PBS洗蓋玻片3次PBS。
16. 滴加二抗（1:1000，Invitrogen公司），室溫下孵育1h。
17. 用0.1M PBS洗蓋玻片1次PBS。
18. 滴加DAPI（1:20,000）孵育5min。
19. 用0.1M PBS洗蓋玻片3次PBS。
20. 用Aqua-Mount封片劑封片。
21. 通常情況下， “吞噬指數(shù)”可以根據(jù)CD11b的小膠質(zhì)細(xì)胞總面積除以NPC標(biāo)記的總面積來計算。
22. 在共聚焦顯微鏡下用Z- stacks拍照檢驗NPC吞噬實驗的有效性。
