流式細(xì)胞術(shù)急性分離小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)概要
本文主要講述了：從成年小鼠腦中分離單細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，我們一個(gè)單細(xì)胞分離成單細(xì)胞懸液，除去髓鞘碎片，然后染色標(biāo)記，以確定小膠質(zhì)細(xì)胞的成分。細(xì)胞被固定，在多色流式細(xì)胞儀上讀取。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 小鼠用pH值7.4，0.1M PBS徹底穿心灌注。
2. 用剪刀去頭。
3. 剝開頭骨的軟組織。
4. 除去下頜骨。
5. 除去頭骨延髓到上頜骨之間的組織。
6. 手術(shù)剪刀，取出頭骨頂部，順時(shí)針方向切割，開始和結(jié)束于右后鼓膜鉤。
7. 舀出大腦，維持組織的完整性。
8. 立即將腦組織置于預(yù)冷的流式細(xì)胞術(shù)緩沖液中（1％BSA 1mM的EDTA的 pH值7.4 0.1M PBS，50U/ml DNAseI）。如果計(jì)劃標(biāo)記神經(jīng)元，應(yīng)在緩沖液中添加l-谷氨酸以防止在制備過程中的神經(jīng)細(xì)胞死亡。
9. 用杜蒙5＃鑷子從大腦的外表面仔細(xì)剝離腦膜（硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜）。
10. 使用手術(shù)刀作冠狀切口分離大腦和小腦/腦干。
11. 使用鑷子分離小腦和腦干,小心剝離出第四腦室腦膜襯砌。
12. 使用手術(shù)刀，縱向平分，小心剝離出大腦脈絡(luò)叢及相關(guān)的腦膜組織。
13. 進(jìn)一步解剖到所需分析的腦區(qū)（如海馬，大腦皮層等）。
14. 將腦組織轉(zhuǎn)移到15MLTenbroeck homogenizer中，其中含有10毫升冰冷的FACS緩沖液。
15. 輕柔震蕩3次破碎組織。
16. 粗勻漿，經(jīng)過70微米尼龍網(wǎng)狀帶有塑料柱塞的細(xì)胞過濾裝置，每柱2次，產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。
17. 離心細(xì)胞，4oC， 1200 轉(zhuǎn)/10min，棄掉上清液，再加上細(xì)胞流式細(xì)胞儀的緩沖液。
18. 用Miltenyi AutoMACS除去髓磷脂，根據(jù)指示髓鞘去除珠。
19. 1× 流式細(xì)胞儀緩沖液洗細(xì)胞，4oC，1100轉(zhuǎn)/10min，棄掉上清液。細(xì)胞重置在100 UL預(yù)冷的，細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)的緩沖液中再轉(zhuǎn)至細(xì)胞流式細(xì)胞儀管中。
20. 把細(xì)胞標(biāo)記上帶有抗CD11b，CD45的細(xì)胞外的小膠質(zhì)標(biāo)記物、可修復(fù)的LIVE/DEAD染料或者任何其他所需標(biāo)記（例如GFAP，NeuN，CD3e等），4度避光反應(yīng)30min。
21. 洗滌細(xì)胞2次，如步驟19所示。
22. 在100-400uL含1％PFA PBS溶液(0.1M，PH=7.4)中重新懸浮細(xì)胞。4℃避光存儲(chǔ)。
23. 在流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞。
24. 首先用LIVE/DEAD設(shè)置gate，選擇活細(xì)胞，然后依據(jù)脈沖寬度與面積比選擇線性分布細(xì)胞，依據(jù)前向散射與側(cè)散射比來消除碎屑。然后依據(jù)不同細(xì)胞類型的相應(yīng)標(biāo)記來獲得等效和準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
小膠質(zhì)細(xì)胞分離流程示意圖，如圖1
