PCR技術、分子雜交、基因測序、核酸質譜、生物芯片5大分子...
PCR技術、分子雜交、基因測序、核酸質譜、生物芯片5大分子診斷技術解析
據(jù)相關行業(yè)調研數(shù)據(jù)，截至日前，新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒研發(fā)企業(yè)已超過120家，底層技術應用原理大都是以基因擴增技術打底。而這背后所折射出來的，其實就是分子診斷技術大家族。
未來3-5年IVD行業(yè)最具發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)品線是什么?答案無疑是分子診斷。
新型冠狀病毒核酸檢測試劑研發(fā)—分子診斷技術應用
總的來講，分子診斷技術是指以DNA和RNA為診斷材料，用分子生物學技術通過檢測基因的存在、缺陷或表達異常，從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的技術。其基本原理是檢測DNA或RNA的結構是否變化、量的多少及表達功能是否異常，以確定受檢者有無基因水平的異常變化，對疾病的預防、預測、診斷、治療和預后具有重要意義。
按照技術原理，可以將上市分子診斷技術大致劃分為PCR技術、分子雜交、基因測序、核酸質譜、生物芯片5大類。
分子診斷技術大家族
截止2020年3月，分子診斷產(chǎn)品獲批數(shù)量超1200項。從目前市場分子診斷產(chǎn)品來看，基于核酸診斷技術的產(chǎn)品仍占主要。從各類技術類別來看，PCR技術由于壁壘相對較低，國產(chǎn)化程度高，國內企業(yè)布局相對較早，因此基于PCR技術的分子診斷產(chǎn)品占總產(chǎn)品量的70%以上。
從此次新型冠狀病毒肺炎產(chǎn)品注冊就可以看出，PCR技術發(fā)展已經(jīng)很成熟了。下面我們就來逐一解剖一下分子診斷技術這個大家庭！
基因擴增技術（PCR技術）
在1983年，美國人Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction, PCR),這一技術將DNA的變性原理以及復性原理加以利用，采用適溫延伸、高溫變性以及低溫復性，讓核酸片段實現(xiàn)了體外擴增，可將極微量的目標DNA特異地擴增上百萬倍，從而提高對DNA分子的分析和檢測，因為PCR有著很高的靈敏度以及特異性，而且簡便快速，所以這種技術已經(jīng)成為目前臨床基因擴增實驗室接受程度最高的技術。同時，PCR技術又可以分為定量PCR和常規(guī)PCR，定量PCR分為實時熒光定量PCR（RT-PCR）和數(shù)字PCR。
PCR技術大致分類
但伴隨著PCR技術的迅猛發(fā)展,有關這項技術的質量管理問題也日益突出,如何消除各類生物學變量所引起的檢測變異,減少或抑制實驗操作與方法學中的各種干擾因素是PCR技術面臨的難題。比如此次新型冠狀病毒核酸檢測假陰性問題，就是技術面臨的一些現(xiàn)實問題。
基因測序技術
基因測序是直接獲得核酸序列信息的唯一技術手段,是分子診斷技術的一項重要分支。雖然分子雜交、分子構象變異或定量PCR技術在近幾年已得到了長足的發(fā)展,但其對于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設上,因此對基于特定基因序列檢測的分子診斷,核酸測序仍是技術上的金標準。
第1代測序
1975年Sanger與Coulson發(fā)表了使用加減法進行DNA序列測定的方法,隨后Maxam在1977年提出了化學修飾降解法的模型,為核酸測序時代的來臨拉開了序幕。經(jīng)典的Sanger測序技術，被稱作是測序界的金標準。隨著高通量測序技術應用拓展，基因測序技術將不斷升級，也將進一步提高占比，成為未來腫瘤檢測的主要技術。目前測序市場主流為NGS測序平臺。
第二代測序
NGS高通量測序技術又稱第二代的測序技術，就是對幾百萬到數(shù)十億的DNA分子一次性實現(xiàn)并行測序。可對一個物種的全部轉錄組和基因組進行深入、細致地分析。在基因組水平上對未知序列的物種進行從頭測序，獲得該物種的基因序列，為后續(xù)的進一步研究奠定基礎；進行參考序列物種的全基因組測序，并在全基因組這一水平之上進行突變位點的檢測，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子變化。
第三代測序
第三代測序技術的核心理念是以單分子為目標的邊合成邊測序，單分子測序平臺給測序技術帶來新思路，部分已經(jīng)開始商業(yè)化推廣，但尚未達到NGS的規(guī)模。
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相比二代測序，第三代測序技術在臨床上的應用有明顯優(yōu)勢：第三代測序技術不需要PCR擴增，可直接對單個分子進行測序;樣品制備簡單，測序成本進一步降低；可直接讀取RNA的序列和包括甲基化在內的DNA修飾。這些優(yōu)勢可以大大改善臨床基因測序的成本、速度和質量，但單分子測序有通量限制，所以并不適合獨立做全基因組測序，更適于針對有限的、個性化的、目標性的應用。
分子雜交技術
分子雜交就是指兩條有著同源序列的核酸單鏈，通過堿基互補配對這一原則相結合，進而形成雙鏈的這一過程，它能夠通過已知序列的基因探針對目標序列加以捕獲和檢測。
進行雜交的雙方分別是探針以及有待探測的核酸，有待檢測的對象可以選擇基因組的DNA,也可以選擇細胞總DNA,可以對其進行提純，也可以對其進行細胞之內的雜交，也就是細胞原位雜交。必須對探針進行標記，這樣才可以進行示蹤以及檢測。
同位素是最為普遍應用的探針標記物，多使用類化合物地高辛配基（digoxigenin,DIG)標記。核酸分子雜交因具有高靈敏度和高特異性，在分子生物學領域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測等方面因為核酸分子雜交的靈敏度以及特異性都很高，因此這一技術已經(jīng)在克隆基因篩選以及基因組之中待測的基因序列定性、定量檢測之中得到了廣泛的應用。
核酸質譜技術
目前核酸分析所使用的質譜電離技術主要還是采用 ESI 和MALDI。簡單來講，兩種電離技術都是軟電離，ESI 檢測的特點是生物大分子帶多個電荷，質荷比范圍基本在2000 Da 以下區(qū)間，從而能檢測幾萬乃至更大的生物分子；而MALDI 常得到單電荷峰，與飛行時間(TOF)分析器搭配，檢測范圍可以到幾十萬道爾頓。
質譜技術相比于其他檢測技術具有快速、準確、靈敏度高、高通量等優(yōu)點，近年來在核酸的高級結構鑒定、寡核苷酸與小分子的相互作用、DNA 損傷與修飾等領域有著廣泛的應用。
由于生物樣品的復雜性，質譜技術還面臨著一些挑戰(zhàn)和困難。但生物質譜技術是科學研究的有力工具，隨著臨床實驗室對質譜的了解和應用不斷的加深，未來該檢測平臺或可成為規(guī)范實驗室不可或缺的標準裝備。
生物芯片技術
生物芯片技術在最近的一些年里才得到了發(fā)展，這種分析與檢測的技術將分子生物學以及微電子技術之間進行有效結合。因此，這種技術又被稱作基因芯片技術或者是DNA芯片技術。在當今，這一技術在免疫反應以及受體結合等的這些非核酸領域之中得到了廣泛的擴展，出現(xiàn)了組織芯片、細胞芯片、免疫芯片以及蛋白質芯片等，所以又將官這種技術改稱作生物芯片技術。
生物芯片技術是通過微加工和微電子技術，在固相基質表面集成密集排列的分子微陣列，以實現(xiàn)對核酸、細胞、蛋白質、組織以及其他生物分子進行高效、準確的檢測。生物芯片技術的本質特征是將生命科學研究中的樣品制備、生化反應以及檢測分析等過程實現(xiàn)連續(xù)化、集成化及微型化。
微陣列芯片
也就是常說的基因芯片，又稱DNA微陣列(DNA micro-array)、SNP芯片，是把大量已知序列探針集成在同一個基片(如玻片、膜)上，經(jīng)過標記的若干靶核苷酸序列與芯片特定位點上的探針雜交，通過檢測雜交信號，對生物細胞或組織中大量的基因信息進行分析。
與傳統(tǒng)的染色體核型分析技術相比具有更高的分辨率，可識別Kb級別以上的染色體細微失衡?；蛐酒壳耙殉蔀閲鴥韧馀R床遺傳學診斷的一項常規(guī)的技術，在遺傳病檢測、疾病篩查、疾病分型、病原體檢測、個性化用藥等方面均呈現(xiàn)出廣闊的應用前景。全球知名的芯片公司有 Illumina、Affymetrix(于2016年被賽默飛收購)、安捷倫等。
微流控芯片
微流控芯片( microfluidic chip) 由微米級流體的管道、反應器等元件構成，與宏觀尺寸的分析裝置相比，其結構極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比，以最大限度利用液體與物體表面有關的包括層流效應、毛細效應、快速熱傳導和擴散效應在內的特殊性能，從而在一張芯片上完成樣品進樣、預處理、分子生物學反應、檢測等系列實驗過程。目前使用微流控芯片進行指導用藥的多基因位點平行檢測是主要臨床應用領域。
總結：分子診斷市場未來可期！
分子診斷技術的應用不僅深化對疾病發(fā)病機制分子生物學的基礎研究，而且不斷擴大了分子診斷疾病的病種，隨著人類基因組計劃的完成和蛋白質組計劃的啟動，分子診斷方法將極大地推動現(xiàn)代檢驗醫(yī)學的迅速發(fā)展，并通過這些基本技術的衍生、聯(lián)合產(chǎn)生新的分析方法，從而提高分子診斷的特異性、敏感性和準確性，為臨床醫(yī)學診斷和治療提供更準確的數(shù)據(jù)和信息。
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產(chǎn)品技術
